MALDI Spotter / Mikro Fraktionskollektor
SunCollect
MALDI Imaging und kontinuierliche Ablage

Ähnlich wie in der analytischen HPLC werden auch in der Mikro- bzw. Nano-HPLC die getrennten Substanzen (Peaks) in Fraktionen aufgefangen. Entweder werden sie in besonderen Behältnissen wie z.B. Mikrotiterplatten (MTP) oder für die MALDI-MS auf entsprechende "Targets" gesammelt(gespottet).

SunCollect kann beide Varianten sehr erfolgreich; als i-Tüpfelchen können sogar Fraktionen auf bzw. in zwei Behältnisse gleichzeitig fraktioniert werden. Ist der Gesamtfluss zu groß, kann partiell auf einem MALDI-Target und die Hauptfraktion in einer Mikro-MTP gesammelt werden. Damit geht kein Eluat (= Substanzen) verloren.

Als "non-plus-ultra" machtt eine Lernsoftware die Programmierung neuer Vorlagen zu einem Kinderspiel. Die Proben bzw. Fraktionen kommen auf ihrem Weg nur mit Quarzglas oder PEEK in Berührung; damit ist der MALDI-Spotter SunCollect per se biokompatibel.

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Besonderheiten des MALDI-Spotters SunCollect

SunCollect zeichnet sich durch mehrere Ausnahmeeigenschaften aus:

1. Ausgezeichnete Präzision
2. Sammeln auf zwei Platten/Behältnissen gleichzeitig
3. Extrem schnell; Wechsel vom Spot zu Spot < 1 Sekunde
4. Sowohl vom Platzbedarf als auch von Volumen her sehr klein
5. Schnell-Trocknung der Spots (Option)
6. Komplett biokompatibel durch Probennadel aus Quarzglas
7. Sehr kleine, präzise Spots möglich
8. Sehr gute Mischung des Eluats mit dem Matrix
9. Optionale, gesteuerte Matrixpumpe
10. Durch mitgeliefertes, leicht erlernbares und sehr leistungsfähiges Steuer und Lernprogramm flexibel und sehr einfach auf neue Vorlagen programmierbar
11. Im Vergleich zu anderen Geräten sehr günstige Preise
12. MALDI Imaging sowie kontinuierliches Spotten als Linie statt diskrete Spots

Die ausgezeichnete Präzision vermeidet nicht nur ein Vermischen benachbarter Spots, kann sogar eine Verkürzung der Messzeiten bewirken, weil der Laserstrahl des MALDI-MS nicht lange nach auswertbaren Flächen abtasten muss.

Abb.1 Präzision beim Spotten auf schwierige Targets 100, 192 und sogar bis zu 5625 Spots auf einer Fläche von 5x5 cm (Mikroskopaufnahme)

Manche Targets besitzen eine auf Hochglanz polierte und dadurch hydrophobe Oberfläche. Die Verteilung der kleinen Tropfen kann kaum beherrscht werden, wenn die Nadel direkt oder nur mit einem sehr geringen Abstand über der Oberfläche steht.

Neueste Untersuchungen haben eindeutig gezeigt, dass das Ablegen eines Tropfens am besten gelingt, wenn

1. die Nadel nicht die Oberfläche berührt,
2. der Tropfen sich zunächst symmetrisch am Ende der Quarznadel formen kann,
3. beim Ablegen die Nadel geringfügig zur Oberfläche gesenkt wird,
4. eine gewisse, an die Zusammensetzung angepasste Zeit abgewartet wird, damit sich ein gleichmäßiger Tropfen auf der Oberfläche bilden kann,
5. genügend Zeit zur Verfügung steht, damit der Flüssigkeitsfilm über Kapillarkräfte von der Nadelaußenwand herabgleiten kann, um Verschleppung zu minimieren.

Sammeln auf zwei Platten/Behältnissen gleichzeitig eröffnet die Möglichkeit, bei hohem Fluss sowohl ein MALDI-Target zu bespotten als auch die restliche Menge in einer MTP aufzufangen. Dadurch ist ein Verlust kostbarer Probe vermieden, Abb. 2.


Abb.2 Doppelvorlage zum Spotten und Sammeln

Eine weitere Anwendung besteht darin, in der 2-dimensionalen Mikro/Nano-HPLC während der 1. Dimension (meistens Ionenaustausch) das Eluat hauptsächlich in MTP zu sammeln, aber auch sehr kleine Mengen auf Targets für Vorinformationen zu spotten.

Schneller Wechsel von Spot zu Spot in weniger als 1 Sekunde ermöglicht eine Fraktionierung bei hohen Flussraten wie z.B. bei Mikro-HPLC. Die Spots auf der Abb. 1 links wurden bei einer Fraktionierzeit von einer Sekunde erzeugt. Hier sieht man nicht nur die Positioniergenauigkeit, sondern auch die hohe Dosierpräzision. Die Spots sind nämlich alle exakt in der Spotmitte und gleich groß. Durch die Probennadel aus Quarz mit einem Außendurchmesser von nur 360 μm können sehr kleine und präzise Spots erzielt werden; Abb. 1 rechts mit 2500 Spots auf einer Fläche von nur 50 x 50 mm.

Da das Eluat ausschließlich mit PEEK und Quarz in Berührung kommt, ist SunCollect ohne Abstriche biokompatibel, die sehr oft ein wichtiges Kriterium für Enzyme oder Metall empfindliche Verbindungen oder intakte Proteine ist, Abb. 3.


Abb.3 Biokompatible Probennadel aus Quarz

Sowohl vom Platzbedarf als auch vom Volumen her dürfte SunCollect der kleinste Mikrofraktionskollektor auf dem Markt sein. Die Trocknungsgeschwindigkeit der Spots hat einen großen Einfluss auf die Kristallgröße der Matrix. Für homogenere und deutlich kleinere Kristalle sorgt der als Option angebotene und seitlich angebrachte Lüfter, wobei die Luftmenge einstellbar ist. Eine Schnelltrocknung der Spots schont auch empfindliche Substanzen; sie befinden sich effektiv nur für kurze Zeit unter Lufteinfluss in Lösung; Abb. 4. Fast alle empfindlichen Verbindungen sind in kristallinem Zustand erheblich stabiler als in der Lösung.


Abb.4 Sehr kleine Dimensionen des SunCollect mit dem Lüfter zur Schnelltrocknung

Die optional lieferbare Matrixpumpe fördert selbst im Pikoliterbereich sehr präzise und zuverlässig. Durch die extrem hohe Auflösung der Förderrate können relativ große Spritzen eingesetzt werden. Dadurch entfällt das öftere Nachfüllen der Spritzen, in der Abb. 4 links oben. Die Kapillarlänge von der Photometerzelle bis zum T-Stück ist wegen der günstigen Dimension des SunCollect sehr kurz und dadurch die Verzögerungszeit entsprechend kurz.

Ein Mikro-T-Stück mit einem Totvolumen von wenigen Nanolitern verbindet die Quarzkapillaren aus der HPLC und Dosierpumpe mit der Probennadel und sorgt für eine optimale Durchmischung ohne wesentliche Peakverbreiterung. Um unerwünschte Adsorptionseffekte zu vermeiden wird die Polyimidschicht der Nadel entfernt. Eine patentierte Halterung und das Nadeldesign schließt einen Bruch der Nadel praktisch aus, Abb. 5

             
Abb.5 Nadelarm und die spezielle, patentierter Nadelhalterung sowie Mikro-T-Stück als Mischer/Verbinder aus PEEK mit nur wenigen Nanolitern Eigenvolumen

Kontinuierliche Eluatablage


Abb. 6 Kontinuierliche Eluatablage in Linien ohne Rückvermischung
Die Zusammenfassung des Eluats in Spots erweist sich sehr oft nachteilig, weil dadurch die bereits auf der Trennsäule mehr oder weniger getrennten komplexen Stoffgemische in einem Spot wieder gemischt werden können. Das unterscheidet MALDI auch von anderen Online-Systemen wie HPLC-ESI/API-MS.

Dieser Nachteil kann dadurch überwunden werden, wenn die Nadel auf der Targetoberfläche bleibt und kontinuierlich bewegt wird. Dadurch entstehen, anstatt Spots Linien. Speziell von SunChrom entwickelte und unbeschichtete Targetoberfläche garantiert unterbrechungsfrei Linien bei jeder Eluentenzusammensetzung, Abb. 6.

Eine Schnelltrocknung vermeidet weitestgehend eine Rückvermischung durch Diffusion. Dadurch können mit bestimmtem MALDI-MS online ähnliche Ergebnisse erzielt werden, indem der Laserstrahl diese Linien folgt und neben Matrix auch die Analyten in die Dampfphase bringt.

Auch hier kann ein Target optimal für mehr las eine Analyse benutzt werden. In der Sequenztabelle wird festgelegt, ob das Eluat wie gewohnt gespottet oder in Linien aufgetragen wird. Am Ende der Eintragzeile wird eine dieser Optionen gewählt, siehe Abb. 7a. Die Eingabe "Fraction Time" bedeutet hier allerdings die Vorschubgeschwindigkeit und zwar die kleinste Auflösung pro Zeiteinheit. Konkret heißt dann diese Größe in der ersten Zeile 0,125 mm pro 0,5 Sekunden und damit 0,25 mm/s.

Wird eine Sequenztabelle mit kontinuierlicher Ablage geladen, ändert sich die Targetvorlage dementsprechend, Abb. 7b. Das Fortschreiten der Ablage nach dem Start wird durch Blaufärbung der bereits zurückgelegten Strecke optisch hervorgehoben.

Abb.7a Sequenztabelle für kontinuierliche Eluatablage	Abb.7b Targetdarstellung bei einer kontinuier- lichen Ablage

MALDI Imaging

Der erste Schritt in der Proteomforschung ist die Trennung / Isolierung und Strukturaufklärung der einzelnen Proteine in Organismen. Der nächste Schritt ist die Erforschung der biologischen Funktion einzelner Spezies. In dieser Richtung gibt es mehrere theoretische Wege. Eine der erfolgversprechenden Wege ist herauszufinden, in welchen speziellen Regionen des Organismus welche Proteine vorhanden sind. Demnach können Korrelationen zwischen den Proteinen und deren biologische Funktion möglicherweise erstellt werden.

R. Lemaire et.al. of "MALDI Imaging Team" der "Université des Sciences et Technologies de Lille; Frankreich", präsentierten auf der ASMS-Tagung 2006 einen Beitrag mit dem Titel "MALDI tissue direct analysis and imaging on Formalin Fixed Paraffin-Embedded Tissues", der die Erforschung der Parkinson-Krankheit zum Thema hatte.

Sie haben einen sehr dünnen Mikrotomschnitt eines Rattenhirnes auf eine Glasscheibe fixiert. Dieser wurde zunächst auf der gesamten Fläche mit einer Trypsinlösung gespottet. Durch den Einsatz einer nur 260μm feinen Quarznadel konnte eine sehr hohe Dichte erzielt werden. Die Nadel wurde dabei auf der Schnittoberfläche behalten und ca. 100 nL Enzym aufgetragen. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass die Trypsinlösung ohne zu trocknen tief in das Gewebe eindringen konnte.

Nach der Inkubationszeit wurden die bereits vorbehandelten Spots dieses Mal mit der MALDI-Matrix (HCCA mit 10mg/mL) beaufschlagt und nach Trocknen mit einem MALDI TOF/TOF–Gerät analysiert.

Abb. 8 zeigt sehr interessante Ergebnisse über die Verteilung einiger speziellen Proteine über die gesamte Gewebefläche. So konnte eindeutige anatomische Regionen aufgezeigt werden, wo einige Proteine dominierten bzw. Fast abwesend waren.

Diese Ergebnisse waren nur durch die tiefe Penetration der Lösungen ins Gewebe ohne Trocknungsverluste möglich. SunCollect bietet diese spezielle Technik als ein Werkzeug an und eröffnet in der Proteomforschung eine sehr interessante Möglichkeit.


Abb.8 Verteilung von Proteinen in unterschiedlichen Regionen des Rattenhirns (Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Salzet and Dr. Fournier, Université des Sciences et Technologies de Lille, Frankreich)

Die SunCollect Steuer-Software

Die besonderen Merkmale der sehr leistungsfähigen Steuerungssoftware sind:

1. Bis zu 4 MALDI-Targets können benutzt werden
2. Alle Targets dürfen unterschiedliche Formate haben
3. Mikrotiterplatten (MTP) können ebenfalls eingesetzt werden
4. Für Folien kann die Spotgeometrie vom Anwender selbst entworfen werden
5. Neben Standard-Targets können alle zukünftigen Targets integriert werden.
6. Unterschiedliche Sammelmodi für jedes Target
7. Gleichzeitige Fraktionierung auf 2 Vorlagen (Target + MTP)
8. Teilung eines Targets in Segmente und dadurch optimale Nutzung der Spots
9. Start der Fraktionierung manuell durch Mausklick, automatisch durch Kurzschlusssignal oder DDE-Verbindung.
10. Sehr einfach zu bedienendes Lernprogramm für neue Targets
11. MALDI-Imaging sowie kontinuierliche Eluatablage

Abb.9a Suncollect Hauptmenue	Abb.9b Vorlagenprogrammierung
Abb.9c + 9d Lernprogramm

Die Vorlagenkombination wird auf dem Monitor visualisiert und erleichtert damit den Umgang mit der Soft- und Hardware. Wurde die Fraktionierung gestartet, so werden die belegten Spots mit einer Farbveränderung angezeigt. Auch ein manuelles Bewegen der Probennadel kann durch das Anfahren mit der Mausspitze an eine bestimmte Position und der linken Maustaste erfolgen, Abb. 9a.

Die Geometrie der Vorlagen und die Z-Achsenpositionen werden in einer visuellen Datei gespeichert, Abb. 9b. Hier befinden sich außerdem die Angaben über die Reihenfolge der Spots, Nummerierung, Position des Startpunktes etc. Die Ablagemodi der Tropfen werden ebenfalls hier definiert.

Die obere Hälfte dieses "Rack-Setup-Fensters" beinhaltet das "Lernprogramm". Durch bestimmte Tastenkombination wird die Probennadel zunächst an die zwei diagonale Eckpositionen gefahren (x- und y-Achsendefinition). Dann erfolgt die z-Achsenpositionierung über bzw. in die Vorlage. Auf diese Weise können neue Vorlagen elegant und schnell erstellt werden. Lediglich die Anzahl der Positionen müssen vom Anwender selbst eingetragen werden, Abb. 9c + 9d.



Abb.10 Sequenztabelle
Die eigentliche Fraktionierung wird über eine Zeittabelle (Sequence table) programmiert. In dieser Tabelle werden die Angaben über Startverzögerung, Position der Vorlagen, Startpositionen und die Dauer der einzelnen Fraktionen sowie die Gesamtfraktionierzeit eingetragen, Abb. 10. Hier besteht die Möglichkeit, die Spots auf einer Vorlage optimal zu nutzen. Schon nach der Angabe der Gesamtfraktionierzeit und Dauer der einzelnen Fraktionen wird die Position des letzten Spots berechnet und angezeigt. So kann der Anwender sofort die nächste Sequenz eintragen, ohne langwierige Berechnung oder Auslassung von Spots als Sicherheitsabstände. Beim Start überprüft die Software automatisch, ob das Programm mit den aktuellen Vorlagen im Gerät übereinstimmt.

Nach dem Laden einer Zeittabelle kann die Fraktionierung durch einen Mausklick auf den "Start-Punkt" oder automatisch durch ein Kurzschlusssignal oder wahlweise durch die DDE-Verbindung erfolgen. Diese Angaben sind ebenfalls ein Bestandteil der Zeittabelle. Mit dem Start läuft auch die Dosierpumpe automatisch an.

Hinweis:
Mehrere oben beschriebene Leistungsmerkmale sind zum Patent angemeldet, auch wenn sie im Text nicht explizit erwähnt werden. Daher sind sie nicht frei, sondern Eigentum der SunChrom GmbH. Sie dürfen weder gänzlich oder teilweise bei anderen Geräten eingesetzt werden. Ohne schriftliche Genehmigung von SunChrom dürfen obige Texte oder Abbildungen, auch auszugsweise, weder kopiert, noch vervielfältigt oder ohne Quellenangabe verwendet werden.

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Geräteausstattung
Anzahl der Targets	max. 4 ABI Targets (100 oder 192 spots)
Bereits adaptierte Targets oder adaptierbare Targets	Bruker; ABI; MicroMass etc. sowie MTP (96 oder 384 Positionen) oder jede andere
Nadelmaterial	Quarz; 360/50 Mikrometer AD/ID; andere Materialien oder Durchmesser auf Anfrage
Vorschubgeschwindigkeit zwischen zwei Spots	< 1 s (gemessen beim Wechsel bei ABI100-Target zwischen zwei benachbarten Spots und 2 mm Z-Achsenbewegung)
Auflösung der Achsvorschübe	X-Achse: ca. 0.016 mm Y-Achse: ca. 0.0038 mm Z-Achse: ca. 0.0049 mm
Softwareausstattung
Anzahl der programmierbaren Targets	4 zum gleichzeitigen Sammeln und Spotten; MALDI imaging; kontinuierliche Ablage
Anzahl der Fraktioniersequenzen	keine Begrenzung; nur limitiert durch die Festplattenkapazität
Festplatten-Speicherbedarf	ca. 2 MB (256 MB RAM empfohlen)
Windows kompatibilität	Windows 2000; XP
Allgemeines
Dimensionen	36W x 49D x 40H cm (14.2x19.3x15.8 in)
Gewicht	18 kg
Spannungsversorgung	100 - 240 VAC 50/60 Hz (externes Netzteil)
Optionale Spritzenpumpe	Chemyx 24 x 17 x 14 cm (9.5xc6.7x5.5 in) 2,5 kg Harvard 22 x 12 x 16 cm (8.8x4.8x6.4 in) 1,8 kg

Wir behalten uns das Recht vor, Spezifikationen, Design oder Preise ohne vorherige Ankündigung zu ändern.

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Artikelnummer	Kurzbeschreibung

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