Profilyzer – Bestimmung von Zuckern und Alkoholen

Die Bestimmung der Zucker (Saccharose, Glucose, Fructose) und der Alkohole (Glycerin, Ethanol) gehört zur täglichen Routine in der Getränkeanalytik. Die quantitative Bestimmung dieser Parameter wird durch die HPLC erreicht, wobei die erforderliche Probenvorbereitung vollautomatisch abläuft. Das Profilyzer-System von SunChrom beinhaltet alle für diese Analytik benötigte Komponenten.

Die Stärke der Methode liegt darin, dass sowohl die Matrix als auch die genannten Substanzen getrennt und damit als Einzelsubstanzen detektiert und refraktometrisch bestimmt werden. Das System kann entweder mit Reinsubstanzen oder mit einem Standardwein kalibriert werden. Als Fließmittel wird nur Wasser verwendet. Diese Analytik ist somit umweltschonend und preisgünstig.

Der SunChrom Profilyzer ist die einzige amtlich zugelassene HPLC-Methode für die Bestimmung der Zucker und Alkohole. Die Methode eignet sich sowohl für Weiß- als auch für Rotweine, für Süßreserven und nach Verdünnung sogar für Obstbrände oder Liköre.

Bestimmung von Restalkohol in alkoholfreien Weinen und Sekten

Das geltende Weinrecht änderte sich zum 01.01.2023 insofern, dass neben der nationalen Weinverordnung auf europäischer Ebene ein einheitlicher Rechtsrahmen für entalkoholisierte und teilweise entalkoholisierte Weine und Schaumweine etabliert wurde (siehe ddw 24/22 Seite 12-13). Der Begriff „alkoholfrei“ oder 0,0 % Alkohol ist jedoch nur noch für Erzeugnisse zulässig die einen Restalkoholgehalt von bis zu 0,049 % v/v aufweisen. Ab 0,05 % bis 0,5 % ist der Zusatz „<0,5 %“ erforderlich.

Neuere Produkte ab dem 01.01.2023 sind daher nach der neuem Weinrecht zu kennzeichnen.

Die Analytik von so kleinen Alkoholmengen ist jedoch problematisch. Bisher werden alkoholische Produkte wie Wein und Sekt auf 0,5 % v/v genau auf- bzw. abgerundet angegeben. Diese Angaben können auf entalkoholisierte bzw. alkoholfreie Weine aus genannten Gründen keine Anwendung finden. Gängige Analysemethoden wie die Destillation liefern nicht die benötigte Genauigkeit und sind somit für die Routinebestimmung nicht anwendbar. In der Referenzmethode wird der Alkoholgehalt mittels eines 50ml Pyknometers über die Dichte bestimmt. Für die zu bestimmende Dichte ρ_FI gilt hierbei:

Mit:
m₀ = Masse des leeren Pyknometers
m₁ = Masse des mit Wasser gefüllten Pyknometers
m₂ = Masse des Pyknometers, gefüllt mit der zu untersuchenden Flüssigkeit
ρ_w =die Dichte von Wasser bei der gegebenen Temperatur

Eine 50 ml-Lösung, die 0,01 % v/v Ethanol enthält, würde die Masse gegenüber reinem Wasser um nur 0,95 mg ändern. Diesen sehr kleinen Gewichtsunterschied im Routinebetrieb zu bestimmen, ist nahezu unmöglich. Auch praktisch würde diese Bestimmung enorme wägetechnische Anforderungen bedeuten. Selbst an der Gefäßwand anhaftendes Restwasser nach einer Wasserbad-Temperierung würde einen enormen Einfluss auf das Ergebnis haben. Dieses restlos zu entfernen würde das Laborpersonal allerdings vor unlösbare Probleme stellen. Um die Gewichtsunterschiede zu messen, braucht man eine hochpräzise Mikrowaage. Gebräuchliche Mikrowaagen haben eine maximale Belastbarkeit von ca. 10 g. Damit übersteigt ein 50 ml Pyknometer die Belastbarkeit um ein Vielfaches. Somit ist das Referenzverfahren nicht effektiv anwendbar.

Andere Verfahren wie FT-NIR oder ähnliche Verfahren können solche kleinen Mengen neben den anderen Wein- und Sektbestandteilen wie Zucker etc. (etwa 10-100 g/L) nicht zuverlässig bestimmen. Auch durch ein enzymatisches Verfahren, wobei offenen Probengefäße zur Verwendung kommen, ist eine Bestimmung so kleiner Ethanolkonzentrationen neben 10-16% v/v Alkohol enthaltenen Proben wegen des Übersprech-Phänomens ebenfalls nicht möglich.

Abb. 1 Chromatogramm Alkohol-Bestimmung eines alkoholfreien Sektes mit 0,252 % v/v gemessenen Alkohols.

Die HPLC bietet als einzige Methode die Möglichkeit auch neben anderen Bestandteilen im Gramm-Bereich auch extrem kleine Alkoholmengen zuverlässig zu bestimmen. Hierbei kommen die bereits 1988 amtlich zugelassene HPLC-Methoden mit dem speziellen Säulensatz zur Anwendung. Die Kalibration mit den hergestellten Alkohol-Wasser-Gemischen in den Konzentrationen zwischen 0,01 % v/v Alkohol bis 1 % v/v Alkohol-Konzentrationen ergibt einen Korrelationskoeffizienten von r=0,999281 und r2 = 099856.

Abb. 2 Mehrstufige Kalibrierung

Liste 1 Alkoholfreie Weine und Sekte

(Wobei die Streuung wahrscheinlich nach Herstellungsart erheblich ausfällt.)

Fazit:

Die neuere Bestimmungsmethode mittels HPLC erlaubt mit geeigneten Säulen eine relativ einfache und ohne zusätzliche Probenvorbereitung durchzuführende, automatische Bestimmung von sehr kleinen Alkoholkonzentrationen neben den dazu gehörigen Zuckern und Glycerin-Werten innerhalb von nur 8 Minuten pro Probe.

Bestimmung der organischen Säuren in Wein

Das Säure-Screening-System von SunChrom wurde für die Bestimmung aller relevanten organischen Säuren in Wein, Sekt und Fruchtsäften in einem einzigen Analysengang entwickelt. Es bietet dem Anwender die Möglichkeit, in kürzester Zeit einen Überblick über die organischen Säuren eines Getränkes zu erhalten. Dadurch ergeben sich äußerst wertvolle Informationen über den momentanen Zustand der Probe bzw. über deren Werdegang im Produktionsprozess. Die quantitative Bestimmung dieser Parameter wird durch die HPLC erreicht, wobei für die Analyse mit der Säure-Screening-Anlage prinzipiell keine Probenvorbereitung erforderlich ist. Die Beseitigung der Matrixeffekte geschieht vollautomatisch, ohne dass der Anwender davon etwas merkt.

SunChrom bietet eine sehr einfache und effiziente Kalibriermöglichkeit der Säure-Screening-Anlage durch einen wässrigen Säurestandard.

Die Stärke dieser Methode liegt darin, dass sowohl die Matrix als auch die genannten Substanzen getrennt werden und damit als Einzelsubstanzen detektiert und UV-photometrisch bestimmt werden. Aus diesem Grund kann das System entweder mit Reinsubstanzen oder mit einem Standardwein kalibriert werden. Als Fließmittel wird nur verdünnte Schwefelsäure (1 mL auf 1 L Wasser) verwendet. Damit ist diese Analytik nicht nur umweltschonend, sondern auch sehr preisgünstig. Die Analysenzeit für die wichtigsten Säuren (Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Essigsäure, Zitronensäure) beträgt unter 20 Minuten. Es ist aber möglich, andere interessante Säuren wie Shikimisäure, Bernsteinsäure oder Fumarsäure ohne zusätzlichen Zeitaufwand zu bestimmen.

Eine der wichtigsten Vorteile der chromatographischen Bestimmung ist es, besondere Veränderungen in den Proben festzustellen, ohne gezielt danach zu suchen. Dadurch ist es in den letzten Jahren den Benutzern der Säure-Screening-Anlagen gelungen, Produktverfälschungen oder unerlaubte Zusätze sozusagen automatisch zu entdecken bzw. aufzudecken.

Weinanalyse mit dem Standard von SunChrom

Die Säurezusammensetzung im Wein dokumentiert den Säuregehalt von der Ernte bis nach der Gärung. Einige Säuren werden in der Rebe gebildet und andere während der Gärung. Eine „saubere“, schonende Fermentation bei niedrigen Temperaturen erzeugt ein „sauberes“ Chromatogramm mit nur wenigen Peaks. Bei dem biologischen Säureabbau wird durch Milchsäurebakterien Äpfelsäure zu Milchsäure umgesetzt. Dieser Abbau kann sehr einfach festgestellt und sogar im Verlauf beobachtet werden. Einige biologische „Marker“-Säuren wie z.B. bei Burgunder-Rebsorten mit sehr kleiner Shikimisäure Konzentration und Fumarsäure geben zusätzliche Informationen über die Rebsorte bzw. den Reifegrad der Reben sowie die Verwendung von geeigneten Michsäurebakterienstämmen, die die Äpfelsäure in Milchsäure abbauen.

Diese Daten sind mit einem Blick zu sehen und geben jedem, vom Kellermeister bis zum Weineinkäufer, wertvolle Informationen. Der Fachmann spricht sogar von einem „offenen Buch“ des Weines. SunChrom bietet eine sehr einfache und effiziente Kalibriermöglichkeit der Säure-Screening-Anlage durch einen wässrigen Säurestandard.

Unser Säurestandard enthält die folgenden Säuren:

• Weinsäure
• Äpfelsäure
• Shikimisäure
• Milchsäure
• Essigsäure
• Zitronensäure
• Bernsteinsäure
• Fumarsäure

Ascorbinsäure in Weißwein

Ascorbinsäure (Vitamin C) wird des Öfteren Weißweinen zugesetzt, um neben dem Schwefeldioxid (SO2, umgangssprachlich „Schwefel“ genannt), bestimmte Oxidationsprozesse und unerwünschte Fehltöne (untypische Alterungsnote UTA) sowie oxidativ entstandene Geruchsstoffe zu vermeiden oder zumindest auf ein Minimum zu reduzieren. In geringen Mengen findet man Ascorbinsäure in Trauben bzw. frischem Traubensaft bis zu 20 mg/L als natürliches Vorkommen. Diese kleine Menge wird allerdings während des Herstellungsprozesses weitestgehend zu Dehydroascorbinsäure oxidiert.

Ascorbinsäure wird dem Wein im Jungweinstadium in einer Konzentration bis zu 250 mg/L zugesetzt (siehe EG Verordnung Nr. 643/2006 vom 27.4.2006). Die Schutzwirkung der Ascorbinsäure beruht dabei auf folgenden Grundlagen:

• Reduktive Wirkung
  Ascorbinsäure unterstützt die Schutzwirkung des SO₂ gegen Sauerstoffeinfluss
• Radikalfänger
  Sauerstoffradikale werden abgefangen und neutralisiert, die die Bildung von 2-Aminoacetophenon verursachen
• Sensorische Wirkung
  Der Wein wird als fruchtiger und frischer empfunden
• Der Gesamtsäuregehalt wird geringfügig erhöht und der pH-Wert reduziert sich dabei leicht. Diese beiden Auswirkungen erhöhen ebenfalls die Weinstabilität

Zu früh dosiert, kann die Böckserneigung erhöht werden, da manche Schwefelverbindungen zu geruchsintensiven Sulfiden und Merkaptanen reduziert werden.

Aus diesem Grund sollte erst der fertig geschwefelte Jungwein nach der Stabilisierung des SO₂-Wertes üblicherweise mit 50 mg/L Ascorbinsäure versetzt werden.

Die Bestimmung der Ascorbinsäure in Weißwein durch HPLC erfolgt mit einer Spezialsäule und vorgeschalteter Vorsäule. Eine Injektion von ca. 5-10 µL klarem Weißwein ist für die Bestimmung bis in den Bereich von 3-5 mg/L Ascorbinsäure ausreichend. Durch geeignete Säulen-, Elutionsmittel- und Wellenlängenauswahl des UV-Detektors werden störende Matrixeffekte eliminiert; siehe Chromatogramm 1
Einige, insbesondere ausländische Abnehmer wünschen allerdings nicht nur die Bestimmung der aktuellen Konzentration der Ascorbinsäure, sondern möchten auch eine Information darüber haben, wieviel dem Wein überhaupt zugesetzt wurde. Der Grund liegt darin zu überprüfen, ob die maximal zulässigen Mengen überschritten wurden. Darüber hinaus erhält man dadurch eine allgemeine Information darüber, welchen oxidativen Stressbedingungen der Wein ausgesetzt wurde.

Auch das ist mit Hilfe der HPLC nach kurzer Probenvorbereitung möglich, wenn die bereits oxidierte Form Dehydroascorbinsäure wieder zu Ascorbinsäure reduziert und nochmals mit der HPLC untersucht wird. Auf dem Chromatogramm sieht man deutlich, dass die ursprünglich zugesetzte Menge an Ascorbinsäure rund 50 mg/L betragen hat.

Die Bestimmung der Ascorbinsäure in Wein gestaltet sich relativ einfach. Die Fa. SunChrom hat hierfür einen Ascorbinsäurestandard entwickelt, um die HPLC-Anlage zu kalibrieren und quantitative Messungen durchzuführen. Dabei kann neben der exakten Bestimmung des momentanen Gehaltes auch die Menge der ursprünglich zugegebenen Ascorbinsäure ermittelt werden, was weitere Informationen über den Werdegang bzw. Zustand des Weines liefern kann.

Sorbinsäure, Benzoesäure, Konservierungsstoffe

Der Wein kann, wie andere Lebensmittel auch, mit den gesetzlich zugelassenen Stoffen stabilisiert bzw. konserviert werden. Hierzu gehören Benzoesäure oder Sorbinsäure. Eine Konservierung kann angezeigt sein, wenn die Lebensmittel, insbesondere der Wein, nicht fach- und sachgerecht gelagert wird. So stehen die Weinflaschen in Verkaufsregalen vielfach senkrecht und bei zu hohen Lagertemperaturen. Hier können Mikroorganismen und/oder Sauerstoff in die Flasche eintreten, die den Wein verderben.

Einige Länder haben einen maximal zulässigen Grenzwert festgelegt, andere Länder oder Importeure verlangen eine von Konservierungsstoffen freie Ware. Diese Mengenbestimmung bzw. den Beweis der Sorbinsäure-Freiheit erfolgt optimal mit der dafür speziell abgestimmten Anlage von SunChrom.

SunChrom bietet für die Bestimmung der Konservierungsstoffe wie Benzoesäure oder Sorbinsäure eine Spezialsäule bzw. -anlage. Die Kalibration erfolgt mit dem Weinstandard der Deutschen Weinchemiker e.V., der 200 mg/L Sorbinsäure enthält. Die Anlage kann aber auch durch selbst hergestellte wässrige Standards kalibriert werden.

Die Anwender der Säure-Screening-Anlagen von SunChrom können diese Bestimmung mit der Hauptsäule der Säure-Screening-Anlage durchführen, indem die Vorsäule durch eine totvolumenarme Kupplung ersetzt wird. Lediglich die Wellenlänge des UV -Detektors muss auf 254 nm umgestellt werden.
Da diese Säule sehr lang ist, dauert die Analyse ca. 30 Minuten (Abbildung 1.1). Die Detektionsgrenze liegt bei <1 mg/L. Effektiver und erheblich schneller geht es mit der Hochleistungstrennsäule von SunChrom, die zu diesem Zweck neu entwickelt wurde. Hier dauert die Trennung nur noch 10 Minuten. Der Sorbinsäure-Peak ist viel schmaler und sehr hoch. Damit sinkt die Detektionsgrenze auch ohne jegliche Probenvorbereitung in den μg/L-Bereich

Anthocyanfarbstoffe

Die Qualität eines Rotweines wird unter anderem durch die Farbintensität bestimmt. Verantwortlich für die rote bis blaurote Farbe sind die Anthocyane, deren Zusammensetzung von Sorte zu Sorte unterschiedlich ist. In letzter Zeit wird die Farbstoffzusammensetzung auch für die Sortenreinheit eines Weines herangezogen, wobei diese Zuordnung zwischen den Analytikern und Züchtungsforschern kontrovers diskutiert wird.
Die praktische Durchführung dieser Analytik unterscheidet sich grundsätzlich von der Bestimmung der Zucker oder organischen Säuren, welche im isokratischen Modus durchgeführt werden, d.h. im Laufe der Trennung wird die Zusammensetzung des Fließmittels nicht geändert. Durch die unterschiedliche chemische Modifikation der Anthocyane wird eine Gradientenelution angewandt, d.h. die Fließmittelzusammensetzung wird im Laufe der Trennung zum Hydrophoben hin verändert.

Die in der Traubenhaut und im fertigen Wein anzutreffenden Anthocyane sind Glucoside der Stoffe Delphinidin, Cyanidin, Petunidin, Paeonidin und Malvidin. Diese Anthocyanidin-3-glucoside werden der Gruppe der unveresterten Anthocyane zugeordnet. Davon ist das Malvidin-3-glucosid als Hauptkomponente mit einem Anteil von >40 % im Wein vertreten.

Neben diesen freien Anthocyanen sind vornehmlich mit Essigsäure oder p-Cumarsäure veresterte Anthocyane in vielen Reben anzutreffen. Diese werden als Acetate bzw. Cumarate bezeichnet. Sowohl bei den Wildreben als auch Kreuzungen zwischen den europäischen Kulturreben und amerikanischen Rebsorten, den „Hybriden“, findet man neben Monoglucosiden auch Anthocyanidin-3-4-diglucoside.

Aus einem Rotweinspektrum können demnach nicht nur Informationen über die Rebsortenreinheit bezüglich Kreuzungen erhalten werden, sondern auch über die Rebsorte selbst. Ein reiner Spätburgunder zeigt im Farbspektrum keinerlei acylierte oder cumarylierte Ester. Im Spektrum eines Dornfelders sieht man dagegen sehr deutlich diese Ester. Bis zu 3 % Esteranteil wird von den Untersuchungsämtern im Falle eines Spätburgunders toleriert, weil eine solche kleine Menge auch über Filteranlagen in den sonst reinen Wein gelangen kann.

Aus rechtlicher Hinsicht kann ein Wein mit einem deklarationsfreien Verschnittanteil von max. 15 % (bei Süssreservezusatz bis 25 %) hergestellt sein. So kann ein Dornfelderzusatz in einem Spätburgunder anhand eines Spektrenvergleichs berechnet werden.