Profilyzer – Bestimmung von Zuckern und Alkoholen

Die Bestimmung der Zucker (Saccharose, Glucose, Fructose) und der Alkohole (Glycerin, Ethanol) gehört zur täglichen Routine in der Getränkeanalytik. Die quantitative Bestimmung dieser Parameter wird durch die HPLC erreicht, wobei die erforderliche Probenvorbereitung vollautomatisch abläuft. Das Profilyzer-System von SunChrom beinhaltet alle für diese Analytik benötigte Komponenten.

Die Stärke der Methode liegt darin, dass sowohl die Matrix als auch die genannten Substanzen getrennt und damit als Einzelsubstanzen detektiert und refraktometrisch bestimmt werden. Das System kann entweder mit Reinsubstanzen oder mit einem Standardwein kalibriert werden. Als Fließmittel wird nur Wasser verwendet. Diese Analytik ist somit umweltschonend und preisgünstig.

Der SunChrom Profilyzer ist die einzige amtlich zugelassene HPLC-Methode für die Bestimmung der Zucker und Alkohole. Die Methode eignet sich sowohl für Weiß- als auch für Rotweine, für Süßreserven und nach Verdünnung sogar für Obstbrände oder Liköre.

Determination of residual alcohol in non-alcoholic wines and sparkling wines

The applicable European wine law changed on 01.01.2023 insofar as a uniform legal framework for dealcoholized and partially dealcoholized wines and sparkling wines was established at European level in addition to the national wine regulation (see ddw 24/22 page 12-13). However, the term "non-alcoholic" or 0.0% alcohol is now only permitted for products with a residual alcohol content of up to 0.049% (v/v). From 0.05 % to 0.5 %, the addition "<0.5 %" is required.

Newer products from 01.01.2023 on must therefore be labelled according to the new European wine law.

However, the analysis of such small amounts of alcohol is problematic. Until now, alcoholic products such as wine and sparkling wine have been labeled to the nearest 0.5 % (v/v), rounded up or down. This information cannot be applied to dealcoholized or non-alcoholic wines for the reasons mentioned above. Common analysis methods such as distillation do not provide the required accuracy and are therefore not applicable for routine determination. In the reference method, the alcohol content is determined via the density using a 50 ml pycnometer. The following applies to the density to be determined ρ_FI:

Explanations:
m₀ = Mass of the empty pycnometer
m₁ = Mass of the pycnometer filled with water
m₂ = Mass of the pycnometer filled with the liquid to be analyzed
ρ_w = Density of water at the given temperature

A 50 ml solution containing 0.01 % v/v ethanol would change the mass by only 0.95 mg compared to pure water. It is almost impossible to determine this very small difference in weight in routine operation. In practice, this determination would also mean enormous weighing requirements. Even residual water adhering to the vessel wall after a water bath temperature control would have an enormous influence on the result. However, removing this completely would present the laboratory staff with unsolvable problems. A high-precision microbalance is needed to measure the differences in weight. Conventional microbalances have a maximum load capacity of approx. 10 g. This means that a 50 ml pycnometer exceeds the load capacity many times over. And so the reference method cannot be used effectively.

Other methods such as FT-NIR or similar methods cannot reliably determine such small quantities in addition to the other wine and sparkling wine components such as sugar etc. (approx. 10-100 g/L). An enzymatic method using open sample vessels is also unable to determine such small ethanol concentrations alongside samples containing 10-16% v/v alcohol due to the crosstalk phenomenon.

Fig. 1 Alcohol determination of a non-alcoholic sparkling wine with 0.252 % v/v alcohol measured.

HPLC is the only method that offers the possibility of reliably determining extremely small quantities of alcohol in addition to other components in the gram range. The HPLC method already officially approved in 1988 is used here with the special column set. Calibration with the alcohol-water mixtures produced in concentrations between 0.01 % v/v alcohol and 1 % v/v alcohol concentrations results in a correlation coefficient of r=0.999281 and r2 = 099856 (Fig. 2)

Fig. 2 Multilevel calibration with five aqueous ethanol solutions

List 1 Low-alcoholic wines and sparkling wines

(The variation is likely to be considerable depending on the type of production).

Conclusion:

With suitable columns, the newer determination method using HPLC allows a relatively simple and automatic determination of very low alcohol concentrations in addition to the corresponding sugars and glycerol values within only 8 minutes per sample, without additional sample preparation.

Bestimmung der organischen Säuren in Wein

Das Säure-Screening-System von SunChrom wurde für die Bestimmung aller relevanten organischen Säuren in Wein, Sekt und Fruchtsäften in einem einzigen Analysengang entwickelt. Es bietet dem Anwender die Möglichkeit, in kürzester Zeit einen Überblick über die organischen Säuren eines Getränkes zu erhalten. Dadurch ergeben sich äußerst wertvolle Informationen über den momentanen Zustand der Probe bzw. über deren Werdegang im Produktionsprozess. Die quantitative Bestimmung dieser Parameter wird durch die HPLC erreicht, wobei für die Analyse mit der Säure-Screening-Anlage prinzipiell keine Probenvorbereitung erforderlich ist. Die Beseitigung der Matrixeffekte geschieht vollautomatisch, ohne dass der Anwender davon etwas merkt.

SunChrom bietet eine sehr einfache und effiziente Kalibriermöglichkeit der Säure-Screening-Anlage durch einen wässrigen Säurestandard.

Die Stärke dieser Methode liegt darin, dass sowohl die Matrix als auch die genannten Substanzen getrennt werden und damit als Einzelsubstanzen detektiert und UV-photometrisch bestimmt werden. Aus diesem Grund kann das System entweder mit Reinsubstanzen oder mit einem Standardwein kalibriert werden. Als Fließmittel wird nur verdünnte Schwefelsäure (1 mL auf 1 L Wasser) verwendet. Damit ist diese Analytik nicht nur umweltschonend, sondern auch sehr preisgünstig. Die Analysenzeit für die wichtigsten Säuren (Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Essigsäure, Zitronensäure) beträgt unter 20 Minuten. Es ist aber möglich, andere interessante Säuren wie Shikimisäure, Bernsteinsäure oder Fumarsäure ohne zusätzlichen Zeitaufwand zu bestimmen.

Eine der wichtigsten Vorteile der chromatographischen Bestimmung ist es, besondere Veränderungen in den Proben festzustellen, ohne gezielt danach zu suchen. Dadurch ist es in den letzten Jahren den Benutzern der Säure-Screening-Anlagen gelungen, Produktverfälschungen oder unerlaubte Zusätze sozusagen automatisch zu entdecken bzw. aufzudecken.

Weinanalyse mit dem Standard von SunChrom

Die Säurezusammensetzung im Wein dokumentiert den Säuregehalt von der Ernte bis nach der Gärung. Einige Säuren werden in der Rebe gebildet und andere während der Gärung. Eine „saubere“, schonende Fermentation bei niedrigen Temperaturen erzeugt ein „sauberes“ Chromatogramm mit nur wenigen Peaks. Bei dem biologischen Säureabbau wird durch Milchsäurebakterien Äpfelsäure zu Milchsäure umgesetzt. Dieser Abbau kann sehr einfach festgestellt und sogar im Verlauf beobachtet werden. Einige biologische „Marker“-Säuren wie z.B. bei Burgunder-Rebsorten mit sehr kleiner Shikimisäure Konzentration und Fumarsäure geben zusätzliche Informationen über die Rebsorte bzw. den Reifegrad der Reben sowie die Verwendung von geeigneten Michsäurebakterienstämmen, die die Äpfelsäure in Milchsäure abbauen.

Diese Daten sind mit einem Blick zu sehen und geben jedem, vom Kellermeister bis zum Weineinkäufer, wertvolle Informationen. Der Fachmann spricht sogar von einem „offenen Buch“ des Weines. SunChrom bietet eine sehr einfache und effiziente Kalibriermöglichkeit der Säure-Screening-Anlage durch einen wässrigen Säurestandard.

Unser Säurestandard enthält die folgenden Säuren:

• Weinsäure
• Äpfelsäure
• Shikimisäure
• Milchsäure
• Essigsäure
• Zitronensäure
• Bernsteinsäure
• Fumarsäure

Ascorbinsäure in Weißwein

Ascorbinsäure (Vitamin C) wird des Öfteren Weißweinen zugesetzt, um neben dem Schwefeldioxid (SO2, umgangssprachlich „Schwefel“ genannt), bestimmte Oxidationsprozesse und unerwünschte Fehltöne (untypische Alterungsnote UTA) sowie oxidativ entstandene Geruchsstoffe zu vermeiden oder zumindest auf ein Minimum zu reduzieren. In geringen Mengen findet man Ascorbinsäure in Trauben bzw. frischem Traubensaft bis zu 20 mg/L als natürliches Vorkommen. Diese kleine Menge wird allerdings während des Herstellungsprozesses weitestgehend zu Dehydroascorbinsäure oxidiert.

Ascorbinsäure wird dem Wein im Jungweinstadium in einer Konzentration bis zu 250 mg/L zugesetzt (siehe EG Verordnung Nr. 643/2006 vom 27.4.2006). Die Schutzwirkung der Ascorbinsäure beruht dabei auf folgenden Grundlagen:

• Reduktive Wirkung
  Ascorbinsäure unterstützt die Schutzwirkung des SO₂ gegen Sauerstoffeinfluss
• Radikalfänger
  Sauerstoffradikale werden abgefangen und neutralisiert, die die Bildung von 2-Aminoacetophenon verursachen
• Sensorische Wirkung
  Der Wein wird als fruchtiger und frischer empfunden
• Der Gesamtsäuregehalt wird geringfügig erhöht und der pH-Wert reduziert sich dabei leicht. Diese beiden Auswirkungen erhöhen ebenfalls die Weinstabilität

Zu früh dosiert, kann die Böckserneigung erhöht werden, da manche Schwefelverbindungen zu geruchsintensiven Sulfiden und Merkaptanen reduziert werden.

Aus diesem Grund sollte erst der fertig geschwefelte Jungwein nach der Stabilisierung des SO₂-Wertes üblicherweise mit 50 mg/L Ascorbinsäure versetzt werden.

Die Bestimmung der Ascorbinsäure in Weißwein durch HPLC erfolgt mit einer Spezialsäule und vorgeschalteter Vorsäule. Eine Injektion von ca. 5-10 µL klarem Weißwein ist für die Bestimmung bis in den Bereich von 3-5 mg/L Ascorbinsäure ausreichend. Durch geeignete Säulen-, Elutionsmittel- und Wellenlängenauswahl des UV-Detektors werden störende Matrixeffekte eliminiert; siehe Chromatogramm 1
Einige, insbesondere ausländische Abnehmer wünschen allerdings nicht nur die Bestimmung der aktuellen Konzentration der Ascorbinsäure, sondern möchten auch eine Information darüber haben, wieviel dem Wein überhaupt zugesetzt wurde. Der Grund liegt darin zu überprüfen, ob die maximal zulässigen Mengen überschritten wurden. Darüber hinaus erhält man dadurch eine allgemeine Information darüber, welchen oxidativen Stressbedingungen der Wein ausgesetzt wurde.

Auch das ist mit Hilfe der HPLC nach kurzer Probenvorbereitung möglich, wenn die bereits oxidierte Form Dehydroascorbinsäure wieder zu Ascorbinsäure reduziert und nochmals mit der HPLC untersucht wird. Auf dem Chromatogramm sieht man deutlich, dass die ursprünglich zugesetzte Menge an Ascorbinsäure rund 50 mg/L betragen hat.

Die Bestimmung der Ascorbinsäure in Wein gestaltet sich relativ einfach. Die Fa. SunChrom hat hierfür einen Ascorbinsäurestandard entwickelt, um die HPLC-Anlage zu kalibrieren und quantitative Messungen durchzuführen. Dabei kann neben der exakten Bestimmung des momentanen Gehaltes auch die Menge der ursprünglich zugegebenen Ascorbinsäure ermittelt werden, was weitere Informationen über den Werdegang bzw. Zustand des Weines liefern kann.

Sorbinsäure, Benzoesäure, Konservierungsstoffe

Der Wein kann, wie andere Lebensmittel auch, mit den gesetzlich zugelassenen Stoffen stabilisiert bzw. konserviert werden. Hierzu gehören Benzoesäure oder Sorbinsäure. Eine Konservierung kann angezeigt sein, wenn die Lebensmittel, insbesondere der Wein, nicht fach- und sachgerecht gelagert wird. So stehen die Weinflaschen in Verkaufsregalen vielfach senkrecht und bei zu hohen Lagertemperaturen. Hier können Mikroorganismen und/oder Sauerstoff in die Flasche eintreten, die den Wein verderben.

Einige Länder haben einen maximal zulässigen Grenzwert festgelegt, andere Länder oder Importeure verlangen eine von Konservierungsstoffen freie Ware. Diese Mengenbestimmung bzw. den Beweis der Sorbinsäure-Freiheit erfolgt optimal mit der dafür speziell abgestimmten Anlage von SunChrom.

SunChrom bietet für die Bestimmung der Konservierungsstoffe wie Benzoesäure oder Sorbinsäure eine Spezialsäule bzw. -anlage. Die Kalibration erfolgt mit dem Weinstandard der Deutschen Weinchemiker e.V., der 200 mg/L Sorbinsäure enthält. Die Anlage kann aber auch durch selbst hergestellte wässrige Standards kalibriert werden.

Die Anwender der Säure-Screening-Anlagen von SunChrom können diese Bestimmung mit der Hauptsäule der Säure-Screening-Anlage durchführen, indem die Vorsäule durch eine totvolumenarme Kupplung ersetzt wird. Lediglich die Wellenlänge des UV -Detektors muss auf 254 nm umgestellt werden.
Da diese Säule sehr lang ist, dauert die Analyse ca. 30 Minuten (Abbildung 1.1). Die Detektionsgrenze liegt bei <1 mg/L. Effektiver und erheblich schneller geht es mit der Hochleistungstrennsäule von SunChrom, die zu diesem Zweck neu entwickelt wurde. Hier dauert die Trennung nur noch 10 Minuten. Der Sorbinsäure-Peak ist viel schmaler und sehr hoch. Damit sinkt die Detektionsgrenze auch ohne jegliche Probenvorbereitung in den μg/L-Bereich

Anthocyanfarbstoffe

Die Qualität eines Rotweines wird unter anderem durch die Farbintensität bestimmt. Verantwortlich für die rote bis blaurote Farbe sind die Anthocyane, deren Zusammensetzung von Sorte zu Sorte unterschiedlich ist. In letzter Zeit wird die Farbstoffzusammensetzung auch für die Sortenreinheit eines Weines herangezogen, wobei diese Zuordnung zwischen den Analytikern und Züchtungsforschern kontrovers diskutiert wird.
Die praktische Durchführung dieser Analytik unterscheidet sich grundsätzlich von der Bestimmung der Zucker oder organischen Säuren, welche im isokratischen Modus durchgeführt werden, d.h. im Laufe der Trennung wird die Zusammensetzung des Fließmittels nicht geändert. Durch die unterschiedliche chemische Modifikation der Anthocyane wird eine Gradientenelution angewandt, d.h. die Fließmittelzusammensetzung wird im Laufe der Trennung zum Hydrophoben hin verändert.

Die in der Traubenhaut und im fertigen Wein anzutreffenden Anthocyane sind Glucoside der Stoffe Delphinidin, Cyanidin, Petunidin, Paeonidin und Malvidin. Diese Anthocyanidin-3-glucoside werden der Gruppe der unveresterten Anthocyane zugeordnet. Davon ist das Malvidin-3-glucosid als Hauptkomponente mit einem Anteil von >40 % im Wein vertreten.

Neben diesen freien Anthocyanen sind vornehmlich mit Essigsäure oder p-Cumarsäure veresterte Anthocyane in vielen Reben anzutreffen. Diese werden als Acetate bzw. Cumarate bezeichnet. Sowohl bei den Wildreben als auch Kreuzungen zwischen den europäischen Kulturreben und amerikanischen Rebsorten, den „Hybriden“, findet man neben Monoglucosiden auch Anthocyanidin-3-4-diglucoside.

Aus einem Rotweinspektrum können demnach nicht nur Informationen über die Rebsortenreinheit bezüglich Kreuzungen erhalten werden, sondern auch über die Rebsorte selbst. Ein reiner Spätburgunder zeigt im Farbspektrum keinerlei acylierte oder cumarylierte Ester. Im Spektrum eines Dornfelders sieht man dagegen sehr deutlich diese Ester. Bis zu 3 % Esteranteil wird von den Untersuchungsämtern im Falle eines Spätburgunders toleriert, weil eine solche kleine Menge auch über Filteranlagen in den sonst reinen Wein gelangen kann.

Aus rechtlicher Hinsicht kann ein Wein mit einem deklarationsfreien Verschnittanteil von max. 15 % (bei Süssreservezusatz bis 25 %) hergestellt sein. So kann ein Dornfelderzusatz in einem Spätburgunder anhand eines Spektrenvergleichs berechnet werden.